............................................................................................................................................ 2 1 EINLEITUNG ................................................................................................................................... 3 1.1 AUFBAU UND STRUKTUR VON CHROMATIN ................................................................................... 3 1.1.1 Stufen der Chromatin-Kondensation ................................................................................... 4 1.1.2 Euchromatin und Heterochromatin ...................................................................................... 8 1.2 PRINZIPIEN DER STRUKTURREGULATION IN CHROMATIN ............................................................... 8 1.3 ATP-ABHÄNGIGE CHROMATIN-REMODELING-KOMPLEXE .............................................................. 8 1.4 ISWI-FAMILIE DER CHROMATIN-REMODELING-KOMPLEXE .......................................................... 10 1.4.1 Aufbau und Funktionsmechanismus der ATPase ISWI ..................................................... 10 1.4.2 Einflüsse des H4-Schwanz auf die Remodeling-Aktivität von ISWI .................................. 12 1.5 ZIELE ...................................................................................................................................... 12 2 MATERIALIEN UND METHODEN ................................................................................................ 14 2.1 MATERIALIEN ........................................................................................................................... 14 2.1.1 Technische Geräte ............................................................................................................. 14 2.1.2 Chemikalien ....................................................................................................................... 14 2.1.3 Materialien für die Filtration, Dialyse und Proteinreinigung ............................................... 15 2.1.4 E.coli Stämme .................................................................................................................... 16 2.1.5 Enzyme, Kits, DNA-Marker, Protein-Marker und Enzympuffer ......................................... 16 2.1.6 Oligonukleotide (Primer) .................................................................................................... 17 2.1.7 Plasmide ............................................................................................................................ 18 2.1.8 PCR-Amplifikate ................................................................................................................ 19 2.2 PUFFER UND LÖSUNGEN .......................................................................................................... 20 2.2.1 Färbung von Proteingelen ................................................................................................. 20 2.2.2 Puffer für Agaroseund Proteingele .................................................................................. 20 2.2.3 Puffer zur Proteinreinigung von Histonen .......................................................................... 21 2.2.4 Puffer zur Rekonstitution von Oktameren ......................................................................... 21 2.2.5 Puffer zur Proteinreinigung von ISWIFL ............................................................................. 21 2.2.6 Puffer zur Proteinreinigung der Taq-Polymerase .............................................................. 21 2.2.7 Puffer zur Herstellung von Nukleosomen-Arrays .............................................................. 22 2.2.8 Puffer der Chromatin-Remodeling-Assays ........................................................................ 22 2.2.9 Sonstige Puffer und Lösungen .......................................................................................... 22 2.3 METHODEN ZUR VERMEHRUNG, QUANTIFIZIERUNG UND ANALYSE VON DNA ............................... 23 2.3.1 Transformation kompetenter E. coli ................................................................................... 23 2.3.2 Anzüchtung von Bakterienkulturen .................................................................................... 23 2.3.3 Aufreinigung von DNA-Plasmiden ..................................................................................... 23 2.3.4 Gelelektrophorese von Agarosegelen ............................................................................... 24 2.3.5 Ethanolfällung von DNA .................................................................................................... 24 2.3.6 DNA-Gelextrahierung ........................................................................................................ 24 2.3.7 Konzentrationsbestimmung von DNA ............................................................................... 25 2.4 ENTWURF UND SYNTHESE DER PLASMIDE PFMP 226 UND PFMP 227 ........................................ 25 2.4.1 Entwurf von 13-mer Sequenzen mit individuellen Restriktionsschnittstellen .................... 25 2.4.2 Synthese der Plasmide pFMP 226 und pFMP 227 ........................................................... 26 2.5 HERSTELLUNG DER PLASMIDE PFMP 232 UND PFMP 233 ......................................................... 26 2.5.1 Isolierung der 12-mer WT 601 Sequenz ........................................................................... 27 2.5.2 Klonierung der 13-mer Inserts der Plasmide pFMP 226 bzw. 227 in pUC18 .................... 27 2.5.3 Klonierung der Plasmide pFMP 232 und pFMP 233 ......................................................... 27 2.6 HERSTELLUNG VON DNA-FRAGMENTEN FÜR NUKLEOSOMEN-ARRAYS ....................................... 28 2.6.1 Herstellung der DNA-Fragmente für 13-mer Nukleosomen-Arrays .................................. 29 2.6.2 Herstellung der DNA-Fragmente für 25-mer Nukleosomen-Arrays .................................. 29 2.7 METHODEN ZUR ANALYSE UND HERSTELLUNG VON PROTEINEN.................................................. 30 2.7.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ....................................................... 30 2.7.2 Expression rekombinanter Histone in chemisch kompetenten E. coli ............................... 30 2.7.3 Proteinaufreinigung der Histone H2A, H2B und gH4 ........................................................ 30 2.7.4 Expression von ISWIFL in chemisch kompetenten E.coli ................................................... 32 2.7.5 Proteinaufreinigung von ISWIFL (His6 -TEV, full length) ..................................................... 32 2.8 REKONSTITUTION VON HISTONOKTAMEREN ............................................................................... 33 2.9 REKONSTITUTION VON 13-MER UND 25-MER NUKLEOSOMEN-ARRAYS ........................................ 34 2.9.1 Assemblierung von DNA und Oktameren zu Nukleosomen-Arrays .................................. 34 2.9.2 Magnesiumfällung der Nukleosomen-Arrays .................................................................... 35 2.9.3 Qualitätskontrollen der 13-mer und 25-mer Nukleosomen-Arrays .................................... 36 2.10 ANALYTISCHE MAGNESIUMFÄLLUNG VON NUKLEOSOMEN-ARRAYS ............................................. 37 2.11 RESTRICTION-ENZYME-ACCESSIBILITY-ASSAYS ......................................................................... 37 2.11.1 Variation der MgCl2 Konzentration in Chromatin-Remodeling-Assays ......................... 38 2.11.2 Variation der ISWI-Konzentration in Chromatin-Remodeling-Assays ........................... 38 2.11.3 Quantifizierung der Chromatin-Remodeling-Assays ..................................................... 38 2.12 METHODEN ZUR HERSTELLUNG VON MONOUND DINUKLEOSOMEN ............................................ 39 2.12.1 Herstellung der Monomer-DNA-Sequenzen .................................................................. 39 2.12.2 PCR zur Amplifikation der Sequenz PCRA 213 ............................................................ 39 2.12.3 PCR zur Amplifikation der Sequenz PCRA 217 ............................................................ 40 2.12.4 DraIII Verdau und Aufreinigung der PCR-Amplifikate ................................................... 40 2.12.5 Ligation der PCR-Amplifikate PCRA 213 und 217 ........................................................ 41 2.12.6 Herstellung von Dimer-DNA-Sequenzen ....................................................................... 41 2.12.7 Rekonstitution von Monound Dinukleosomen ............................................................. 42 2.12.8 Qualitätskontrollen der Mononukleosomen ................................................................... 42 2.12.9 Qualitätskontrollen der Dinukleosomen ......................................................................... 43 2.12.10 Dinukleosomen-Ligationsversuch .................................................................................. 43 2.13 EXPRESSION UND PROTEINAUFREINIGUNG DER TAQ-POLYMERASE ............................................. 43 2.13.1 Transformation und Expression der Taq-Polymerase ................................................... 43 2.13.2 Induktionskontrollen der Taq-Polymerase pFMP 222 .................................................... 44 2.13.3 Chromatographische Proteinaufreinigung der Taq-Polymerase ................................... 45 3 ERGEBNISSE ............................................................................................................................... 47 3.1 ASSEMBLIERUNG VON 13-MER NUKLEOSOMEN-ARRAYS MIT STÖCHIOMETRISCHEN MENGEN AN HISTONOKTAMEREN ............................................................................................................................. 47 3.1.1 Qualitätskontrollen der 13-mer Arrays ............................................................................... 50