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endodeoxyribonuclease DraIII

Known as: DraIII endonuclease, endodeoxyribonuclease Dra III, endonuclease DraIII 
National Institutes of Health

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Broader (1)

Type II site-specific deoxyribonuclease

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2017
2017
Der Einfluss der Chromatinfaltung auf die Remodeling-Aktivität der ATPase ISWI
............................................................................................................................................ 2 1 EINLEITUNG ................................................................................................................................... 3 1.1 AUFBAU UND STRUKTUR VON CHROMATIN ................................................................................... 3 1.1.1 Stufen der Chromatin-Kondensation ................................................................................... 4 1.1.2 Euchromatin und Heterochromatin ...................................................................................... 8 1.2 PRINZIPIEN DER STRUKTURREGULATION IN CHROMATIN ............................................................... 8 1.3 ATP-ABHÄNGIGE CHROMATIN-REMODELING-KOMPLEXE .............................................................. 8 1.4 ISWI-FAMILIE DER CHROMATIN-REMODELING-KOMPLEXE .......................................................... 10 1.4.1 Aufbau und Funktionsmechanismus der ATPase ISWI ..................................................... 10 1.4.2 Einflüsse des H4-Schwanz auf die Remodeling-Aktivität von ISWI .................................. 12 1.5 ZIELE ...................................................................................................................................... 12 2 MATERIALIEN UND METHODEN ................................................................................................ 14 2.1 MATERIALIEN ........................................................................................................................... 14 2.1.1 Technische Geräte ............................................................................................................. 14 2.1.2 Chemikalien ....................................................................................................................... 14 2.1.3 Materialien für die Filtration, Dialyse und Proteinreinigung ............................................... 15 2.1.4 E.coli Stämme .................................................................................................................... 16 2.1.5 Enzyme, Kits, DNA-Marker, Protein-Marker und Enzympuffer ......................................... 16 2.1.6 Oligonukleotide (Primer) .................................................................................................... 17 2.1.7 Plasmide ............................................................................................................................ 18 2.1.8 PCR-Amplifikate ................................................................................................................ 19 2.2 PUFFER UND LÖSUNGEN .......................................................................................................... 20 2.2.1 Färbung von Proteingelen ................................................................................................. 20 2.2.2 Puffer für Agaroseund Proteingele .................................................................................. 20 2.2.3 Puffer zur Proteinreinigung von Histonen .......................................................................... 21 2.2.4 Puffer zur Rekonstitution von Oktameren ......................................................................... 21 2.2.5 Puffer zur Proteinreinigung von ISWIFL ............................................................................. 21 2.2.6 Puffer zur Proteinreinigung der Taq-Polymerase .............................................................. 21 2.2.7 Puffer zur Herstellung von Nukleosomen-Arrays .............................................................. 22 2.2.8 Puffer der Chromatin-Remodeling-Assays ........................................................................ 22 2.2.9 Sonstige Puffer und Lösungen .......................................................................................... 22 2.3 METHODEN ZUR VERMEHRUNG, QUANTIFIZIERUNG UND ANALYSE VON DNA ............................... 23 2.3.1 Transformation kompetenter E. coli ................................................................................... 23 2.3.2 Anzüchtung von Bakterienkulturen .................................................................................... 23 2.3.3 Aufreinigung von DNA-Plasmiden ..................................................................................... 23 2.3.4 Gelelektrophorese von Agarosegelen ............................................................................... 24 2.3.5 Ethanolfällung von DNA .................................................................................................... 24 2.3.6 DNA-Gelextrahierung ........................................................................................................ 24 2.3.7 Konzentrationsbestimmung von DNA ............................................................................... 25 2.4 ENTWURF UND SYNTHESE DER PLASMIDE PFMP 226 UND PFMP 227 ........................................ 25 2.4.1 Entwurf von 13-mer Sequenzen mit individuellen Restriktionsschnittstellen .................... 25 2.4.2 Synthese der Plasmide pFMP 226 und pFMP 227 ........................................................... 26 2.5 HERSTELLUNG DER PLASMIDE PFMP 232 UND PFMP 233 ......................................................... 26 2.5.1 Isolierung der 12-mer WT 601 Sequenz ........................................................................... 27 2.5.2 Klonierung der 13-mer Inserts der Plasmide pFMP 226 bzw. 227 in pUC18 .................... 27 2.5.3 Klonierung der Plasmide pFMP 232 und pFMP 233 ......................................................... 27 2.6 HERSTELLUNG VON DNA-FRAGMENTEN FÜR NUKLEOSOMEN-ARRAYS ....................................... 28 2.6.1 Herstellung der DNA-Fragmente für 13-mer Nukleosomen-Arrays .................................. 29 2.6.2 Herstellung der DNA-Fragmente für 25-mer Nukleosomen-Arrays .................................. 29 2.7 METHODEN ZUR ANALYSE UND HERSTELLUNG VON PROTEINEN.................................................. 30 2.7.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ....................................................... 30 2.7.2 Expression rekombinanter Histone in chemisch kompetenten E. coli ............................... 30 2.7.3 Proteinaufreinigung der Histone H2A, H2B und gH4 ........................................................ 30 2.7.4 Expression von ISWIFL in chemisch kompetenten E.coli ................................................... 32 2.7.5 Proteinaufreinigung von ISWIFL (His6 -TEV, full length) ..................................................... 32 2.8 REKONSTITUTION VON HISTONOKTAMEREN ............................................................................... 33 2.9 REKONSTITUTION VON 13-MER UND 25-MER NUKLEOSOMEN-ARRAYS ........................................ 34 2.9.1 Assemblierung von DNA und Oktameren zu Nukleosomen-Arrays .................................. 34 2.9.2 Magnesiumfällung der Nukleosomen-Arrays .................................................................... 35 2.9.3 Qualitätskontrollen der 13-mer und 25-mer Nukleosomen-Arrays .................................... 36 2.10 ANALYTISCHE MAGNESIUMFÄLLUNG VON NUKLEOSOMEN-ARRAYS ............................................. 37 2.11 RESTRICTION-ENZYME-ACCESSIBILITY-ASSAYS ......................................................................... 37 2.11.1 Variation der MgCl2 Konzentration in Chromatin-Remodeling-Assays ......................... 38 2.11.2 Variation der ISWI-Konzentration in Chromatin-Remodeling-Assays ........................... 38 2.11.3 Quantifizierung der Chromatin-Remodeling-Assays ..................................................... 38 2.12 METHODEN ZUR HERSTELLUNG VON MONOUND DINUKLEOSOMEN ............................................ 39 2.12.1 Herstellung der Monomer-DNA-Sequenzen .................................................................. 39 2.12.2 PCR zur Amplifikation der Sequenz PCRA 213 ............................................................ 39 2.12.3 PCR zur Amplifikation der Sequenz PCRA 217 ............................................................ 40 2.12.4 DraIII Verdau und Aufreinigung der PCR-Amplifikate ................................................... 40 2.12.5 Ligation der PCR-Amplifikate PCRA 213 und 217 ........................................................ 41 2.12.6 Herstellung von Dimer-DNA-Sequenzen ....................................................................... 41 2.12.7 Rekonstitution von Monound Dinukleosomen ............................................................. 42 2.12.8 Qualitätskontrollen der Mononukleosomen ................................................................... 42 2.12.9 Qualitätskontrollen der Dinukleosomen ......................................................................... 43 2.12.10 Dinukleosomen-Ligationsversuch .................................................................................. 43 2.13 EXPRESSION UND PROTEINAUFREINIGUNG DER TAQ-POLYMERASE ............................................. 43 2.13.1 Transformation und Expression der Taq-Polymerase ................................................... 43 2.13.2 Induktionskontrollen der Taq-Polymerase pFMP 222 .................................................... 44 2.13.3 Chromatographische Proteinaufreinigung der Taq-Polymerase ................................... 45 3 ERGEBNISSE ............................................................................................................................... 47 3.1 ASSEMBLIERUNG VON 13-MER NUKLEOSOMEN-ARRAYS MIT STÖCHIOMETRISCHEN MENGEN AN HISTONOKTAMEREN ............................................................................................................................. 47 3.1.1 Qualitätskontrollen der 13-mer Arrays ............................................................................... 50  
2010
2010
Fast multiple gene fragment ligation method based on Type IIs restriction enzyme DraIII
25 October 2010 1. Purpose With the established BioBrick Assembly standards, ligation of different parts has to be accomplished… 
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