Effectene
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................................................................................................................................................. 6 1. Einleitung ...................................................................................................................................... 7 1.1. Allgemeines zur Tumorbiologie ................................................................................................ 7 1.2. Tumorbiologische Bedeutung der Angiogenese ........................................................................ 8 1.3. Tumorbiologische Bedeutung der Lymphangiogenese............................................................ 11 1.4. Das Pankreaskarzinom............................................................................................................. 12 1.5. Der Tumorsuppressor p16................................................................................................. 13 1.6. Das Angiopoietin Tie-2 System............................................................................................... 16 1.6.1. Der Einfluss von Ang-2 im Rahmen der tumorassoziierten Angiogenese ......................... 19 1.7. Zielsetzung............................................................................................................................... 20 2. Material und Methoden ............................................................................................................. 21 2.1. Material.................................................................................................................................... 21 2.1.1. Biologisches Material ......................................................................................................... 21 2.1.1.1. Eukaryotische Zellen................................................................................................... 21 2.1.1.2. Prokaryotische Zellen.................................................................................................. 21 2.1.2. Medien und Zusätze............................................................................................................ 21 2.1.2.1. Zellkulturmedien und deren Zusätze ........................................................................... 21 2.1.2.2. Nährmedium für Bakterien.......................................................................................... 21 2.1.3. Antibiotika .......................................................................................................................... 22 2.1.4. Enzyme und Enzympuffer .................................................................................................. 22 2.1.5. Antikörper........................................................................................................................... 22 2.1.6. Größenstandards ................................................................................................................. 23 2.1.7. Kits...................................................................................................................................... 23 2.1.8. Puffer und Lösungen........................................................................................................... 23 2.1.9. Software.............................................................................................................................. 24 2.1.10. Chemikalien/Reagenzien .................................................................................................. 24 2.1.11. Sonstige Materialien ......................................................................................................... 25 2.1.12. Geräte................................................................................................................................ 26 2.2. Methoden ................................................................................................................................. 27 2.2.1. Molekularbiologische Methoden ........................................................................................ 27 2.2.1.1. Agarosegelelektrophorese (Elektrophoretische Auftrennung von DNA).................... 27 2.2.1.2. Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA........................................................ 27 2.2.1.3. Klonierung................................................................................................................... 27 2.2.1.4. RNA Isolierung aus Zellen.......................................................................................... 29 2.2.1.5. RT-PCR....................................................................................................................... 29 2.2.1.6. PCR ............................................................................................................................. 30 2.2.1.7. cDNA – Array ............................................................................................................. 30 2.2.2. Proteinbiochemische Methoden.......................................................................................... 31 2.2.2.1. Herstellung von Proteinlysaten ................................................................................... 31 2.2.2.2. Proteinfällung mit Trichloressigsäure (TCA Fällung) ................................................ 32 2.2.2.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ...................................................................... 32 2.2.2.4. Western Blot................................................................................................................ 33 2.2.2.5. Strippen der Membran................................................................................................. 34 2.2.2.6. FACS Analyse............................................................................................................. 34 2.2.2.7. Koloniebildungsassay (HTCA) ................................................................................... 35 Inhaltsverzeichnis ii 2.2.2.8. ELISA.......................................................................................................................... 36 2.2.3. Zellbiologische Methoden .................................................................................................. 37 2.2.3.1. Allgemeine Methoden der Zellkultur .......................................................................... 37 2.2.3.2. Herstellung stabil transfizierter Klone – Transfektion mit Effectene.......................... 37 2.2.3.3. Transiente Transfektion – Calcium Phosphat Transfektion zur Bestimmung der Induktionsstärke ....................................................................................................................... 38 2.2.3.4. Dual-Luciferase Reporter Assay zur Überprüfung der Induzierbarkeit ...................... 38 2.2.3.5. Proliferationsassay mittels Alamar Blue ..................................................................... 39 2.2.4. Tierexperimentelle Methoden............................................................................................. 39 2.2.4.1. Versuchstiere und Haltung .......................................................................................... 39 2.2.4.2. Orthotope Implantation ............................................................................................... 40 2.2.4.3. Retrobulbäre Blutentnahme......................................................................................... 40 2.2.5. Immunhistochemische Methoden....................................................................................... 41 2.2.5.1. Herstellung von Gefrierschnitten ................................................................................ 41 2.2.5.2. HE-Färbung................................................................................................................. 41 2.2.5.3. Immunhistochemische Färbungen an Gefrierschnitten ............................................... 41 3. Ergebnisse.................................................................................................................................... 43 3.1. Generierung des TREx Systems zur induzierbaren Expression von p16 in MiaPaCa-2 Zellen ................................................................................................................. 43 3.2. Stabile Expression des Tet-Repressors in MiaPaCa-2 Zellen.................................................. 44 3.3. Stabile induzierbare Expression von p16 in MiaPaCa-2TREx Zellen .................................. 46 3.3.1. Klonierung der p16 cDNA in den induzierbaren Vektor pcDNA4/TO.............................. 46 3.3.2. Generierung der stabil induzierbaren MiaPaCa-2-TREx-p16 Zelllinie.............................. 47 3.4. Funktionelle Analysen der induzierbaren MiaPaCa-2-TREx-p16 Zelllinie ...................... 48 3.4.1. Die Induktion von p16 in MiaPaCa-2 Zellen führt zu einer Abnahme von Rb .................. 48 3.4.2. Der Einfluss von p16 auf das Wachstum der MiaPaCa-2 Zellen ....................................... 49 3.4.3 Der Einfluss von p16 auf das verankerungsunabhängige Wachstum.................................. 50 3.5. Charakterisierung der in vivo Effekte von induzierter p16 Expression nach orthotoper Xenotransplantation ........................................................................................................... 50 3.5.1. Das orthotope Modell ......................................................................................................... 50 3.5.2. Orthotope Implantation der MiaPaCa-2-TREx-p16 Zellen ................................................ 51 3.5.4. Immunhistochemischer Nachweis der p16 Induktion ........................................................ 53 3.5.5. Der Einfluss von p16 auf das Tumorwachstum.................................................................. 56 3.5.6. Der Einfluss der p16-Überexpression auf die Tumorangiogenese ..................................... 57 3.5.7. Der
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