..........................................................................................................................................2 INTRODUÇÃO .....................................................................................................................................3 Turberculose ...................................................................................................................................3 Agente Etiológico ........................................................................................................................9 Epidemiologia ........................................................................................................................... 10 Tratamento da Infecção ............................................................................................................ 13 Resistência Bacteriana............................................................................................................... 16 Proteases ...................................................................................................................................... 18 Aspártico-proteases .................................................................................................................. 20 Cisteíno-proteases .................................................................................................................... 20 Metalo-proteases ...................................................................................................................... 21 Treonino-proteases ................................................................................................................... 21 Glutâmico-proteases ................................................................................................................. 22 Serino-proteases ....................................................................................................................... 22 Família Prolil Oligopeptidase (S9) .............................................................................................. 23 Proteases em M. tuberculosis .................................................................................................... 28 Modelagem por Homologia e Dinâmica Molecular ........................................................................ 31 Fluorescência intrínseca e sua aplicação no estudo de proteínas ................................................... 34 JUSTIFICATIVA................................................................................................................................... 37 OBJETIVOS ........................................................................................................................................ 38 Objetivo Geral ............................................................................................................................... 38 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................................... 39 Micobactéria e Extração do DNA genômico ................................................................................... 40 Análise de Bioinformática ............................................................................................................. 40 Amplificação do gene Prolil Oligopeptidase de Mycobacterium tuberculosis ................................. 40 Clonagem no vetor de expressão .................................................................................................. 41 Expressão heteróloga e Purificação da proteína recombinante ..................................................... 43 Universidade de Brasília Prolil Oligopeptidase de M. tuberculosis ix Eletroforese em gel de poliacrilamida ........................................................................................... 44 Produção de anticorpos anti-rPOPMt e Western blot .................................................................... 44 Ensaio da Atividade Enzimática ..................................................................................................... 45 Influência do pH e da Temperatura ............................................................................................... 46 Perfil de Inibição da rPOPMt ......................................................................................................... 47 Constante de Michaelis-Menten (Km), velocidade máxima (Vmax), constante catalítica (kcat) e eficiência catalítica (kcat/Km) ....................................................................................................... 47 Espectroscopia de fluorescência.................................................................................................... 48 Modelagem por homologia e Dinâmica molecular......................................................................... 48 Parâmetros de simulação .......................................................................................................... 48 Imunogenicidade da rPOPMt em camundongos e na infecção ...................................................... 49 Animais ..................................................................................................................................... 49 Imunização ................................................................................................................................ 49 Coleta do soro ........................................................................................................................... 50 Elisa .......................................................................................................................................... 50 Avaliação dos componentes celulares e citocinas do baço e pulmão de camundongos imunizados ................................................................................................................................ 50 Análise estatística ..................................................................................................................... 51 Perfil de secreção de citocinas in vitro por macrófagos murinos após incubação com rPOPMt ...... 51 Estimulação de macrófagos peritoneais com rPOPMt in vitro. ................................................... 51 Propriedades imunomoduladoras de rPOPMt ........................................................................... 51 Análise estatística ..................................................................................................................... 52 RESULTADOS..................................................................................................................................... 53 Amplificação e Clonagem do gene popmt ...................................................................................... 53 Expressão Heteróloga e Purificação da rPOPMt ............................................................................. 59 Produção de anticorpos anti-rPOPMt ............................................................................................ 65 Atividade enzimática da rPOPMt ................................................................................................... 66 Especificidade da rPOPMt pelo substrato N-Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-AMC ............................... 66 Influência do pH na atividade enzimática e na estrutura da rPOPMt .......................................... 68 Efeito do tampão na atividade catalítica da rPOPMt .................................................................. 69 Efeitos de NaCl e DTT na catálise da rPOPMt ............................................................................. 70 Influência da Força Iônica na atividade enzimática da rPOPMt .................................................. 71 Influência da temperatura na atividade enzimática e na estrutura da rPOPMt........................... 72 Perfil de inibição da rPOPMt...................................................................................................... 73 Universidade de Brasília Prolil Oligopeptidase de M. tuberculosis x Parâmetros cinéticos da rPOPMt ............................................................................................... 74 Modelagem por homologia e Dinâmica Molecular .................................................................... 75 Imunogenicidade da rPOPMt em camundongos ........................................................................ 79 Perfil de secreção de citocinas in vitro por macrófagos murinos após incubação com rPOPMt .. 81 DISCUSSÃO ....................................................................................................................................... 82 CONCLUSÕES .................................................................................................................................... 89 PERSPECTIVAS .................................................................................................................................. 90 MANUSCRITO Enzymatic properties and molecular dynamics of Prolyl oligopeptidase from Mycobacterium tuberculosis ............................................................................................................. 91 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................................................ 108 Universidade de Brasília Prolil Oligopeptidase de M. tuberculosis