......................................................................................................................................11 1 Einleitung...............................................................................................................................14 1.1 Kautschuk................................................................................................................................14 1.2 Die industrielle Kautschuk-Produktion...................................................................................15 1.3 Der natürliche Abbau von Kautschuk......................................................................................18 1.4 Xanthomonas sp. 35Y..............................................................................................................21 1.5 Rubber oxygenase A (RoxA)...................................................................................................21 1.6 Latex clearing protein (Lcp)....................................................................................................24 1.7 Ziel der Arbeit..........................................................................................................................26 2 Ergebnisse..............................................................................................................................27 2.1 Der Aminosäurerest Phenylalanin an Position 317 ist essentiell für die Aktivität von RoxA ...................................................................................................27 2.1.1 Klonierung und Expression der RoxA-F317-Muteine.........................................................27 2.1.2 Reinigung von RoxA-F317A und RoxA-F317L..................................................................28 2.1.3 Bestimmung der relativen Aktivität von RoxA-F317A und RoxA-F317L..........................28 2.1.4 UVvis-spektroskopische Untersuchung von RoxA-F317A.................................................29 2.2 Das Mutein RoxA-F317Y.......................................................................................................32 4 Inhaltsverzeichnis 2.3 RoxA: Die Position F301........................................................................................................34 2.3.1 RoxA-F301Y........................................................................................................................35 2.4 RoxA: Die Position W291.......................................................................................................37 2.5 Zusammenfassung der relativen Aktivitäten aller vorgestellten gereinigten RoxA-Muteine......................................................................................................39 2.6 Funktionelle Identifizierung von RoxA-orthologen Proteinen in Myxobakterien..........40 2.6.1 Modellierung der dreidimensionalen Struktur der RoxA-orthologen Proteine....................41 2.6.2 Klonierung und Expression der RoxA-orthologen Proteine.................................................42 2.6.3 Reinigung von nativem RoxAMfu und RoxACco.....................................................................42 2.6.4 Die poly(cis-1,4-isopren)-Spaltung durch die gereinigten RoxA-orthologen Proteine........43 2.6.5 UVvis-spektroskopische Untersuchungen von RoxACco und RoxAMfu.................................44 2.7 Die Expression und Charakterisierung von nativem Lcp.................................................46 2.7.1 Klonierung und Expression von Lcp....................................................................................46 2.7.2 Reinigung von nativem Lcp aus dem Kulturüberstand von Xanthomonas sp. 35Y pNH1::lcp.........................................................................................47 2.7.3 Aktivitätsnachweis von gereinigtem Lcp.............................................................................48 2.7.4 Charakterisierung von gereinigtem Lcp...............................................................................50 2.7.5 Einfluss verschiedener Substanzen auf die Aktivität von Lcp.............................................51 2.8 Lcp aus Streptomyces sp. K30 ist ein b-Typ Cytochrom....................................................52 2.8.1 Klonierung und Expression von Strep-Lcp..........................................................................52 2.8.2 Reinigung von Strep-Lcp......................................................................................................52 2.8.3 Bestimmung der Aktivität von Strep-Lcp.............................................................................53 2.8.4 UVvis-spektroskopische Untersuchung von Strep-Lcp.......................................................54 2.8.5 Die Anwesenheit von Metallionen in Lcp............................................................................54 2.8.6 Bestimmung des Häm-Typs von Strep-Lcp..........................................................................54 2.8.7 Untersuchung des aktiven Zentrums von Lcp......................................................................56 Inhaltsverzeichnis 5 3 Diskussion..............................................................................................................................57 3.1 RoxA – Wichtige Aminosäurereste im Bereich der N-terminalen Hämgruppe.......................57 3.2 RoxA: Die Position F317........................................................................................................57 3.2.1 RoxA-F317Y........................................................................................................................60 3.3 RoxA: Die Position F301........................................................................................................62 3.4 RoxA: Die Position W291.......................................................................................................64 3.5 Funktionelle Identifizierung RoxA-orthologer Proteine in Myxobakterien............................66 3.5.1 Die Metabolisierung von Kautschuk....................................................................................68 3.6 Die Reinigung und Charakterisierung von Lcp.......................................................................71 3.6.1 Lcp ist ein b-Typ Cytochrom................................................................................................73 3.7 Der Reaktionsmechanismus der RoxAund Lcp-abhängigen Polyisoprenspaltung.................................................................................................................75 4 Ausblick..................................................................................................................................79 4.1 RoxA........................................................................................................................................79 4.2 Lcp...........................................................................................................................................80 Literaturverzeichnis...............................................................................................................82 Anhang: Publikationen..........................................................................................................92 Erklärung.................................................................................................................................126 Danksagung.............................................................................................................................127 Lebenslauf ...................................................................................................................128 6 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis as isolated Protein im Grundzustand, z.B. nach der Reinigung ASM American Society for Microbiology BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Basenpaare C-terminal Carboxy-terminal CCP(s) Cytochrom c Peroxidase(n) CD Zirkulardichroismus (circular dichroism) CoA Coenzym A DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EPR Elektronen-paramagnetische Resonanz et al. et alii (und andere) ff und folgende g Gramm GHz Gigahertz HC High capacity His-Tag Histidin-Tag (üblicherweise sechs hintereinanderliegende Histidinreste) HPLC High performance liquid chromatography IDO Indolamin-2,3-Dioxygenase K Kelvin LB Lysogeny broth (oft auch als Luria Bertani bezeichnet) LC-MS Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung Lcp (lcp) Latex clearing protein (Gen) LcpVH2 Lcp aus Gordonia polyisoprenivorans Stamm VH2 MADH Methylamin Dehydrogenase MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight MauG Methylamine utilisation protein Abkürzungsverzeichnis 7 Mbp Megabasenpaare N-terminal Amino-terminal nm Nanometer NR Natürlicher Kautschuk (natural rubber) ODTD 12-oxo-4,8-dimethyltrideca-4,8-dien-1-al (RoxA-Hauptspaltprodukt) PAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese PCR Polymerase Kettenreaktion Q-Banden α-Bande und β-Bande im UVvis-Spektrum von Cytochromen (zwischen ca. 500 600 nm) RoxA (roxA) Rubber oxygenase A (Gen) RoxACco Rubber oxygenase A aus Corallococcus coralloides BO35 RoxAHoc Rubber oxygenase A aus Haliangium ochraceum RoxAMfu Rubber oxygenase A aus Myxococcus fulvus HW-1 RoxAXsp. Rubber oxygenase A aus Xanthomonas sp. 35Y rpm Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat Sec Sekretorisches System für Proteine SR Synthetischer Kautschuk (synthetic rubber) Strep-Lcp (strep-lcp) Lcp mit einem Strep-Tag (entsprechende Gensequenz) Strep-Tag Tag mit acht Aminosäuren; Affinität zu Strep-Tactin (artifizielles Streptavidin) TAT Twin-Arginin Transport TDO Tryptophan-2,3-Dioxygenase Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan TTQ Tryptophan-Tryptophyl-Quinon U Units (1 U = 1 μmol / min) UVvis Ultraviolet-visible Wt Wildtyp 8 Zusammenfassung /Abstract