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Flik protein, chicken

Known as: Flik protein, chick 
 
National Institutes of Health

Papers overview

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2016
2016
......................................................................................................................................................................... IX 1 Einleitung .............................................................................................................................................................. 1 1.1 Die Familie der Epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren und ihr Wirken in der Signaltransduktion ................................................................................................................................................. 1 1.2 Die Struktur und Regulation der EGF-Rezeptoren ..................................................................... 3 1.3 Small Molecules als Kinaseinhibitoren ............................................................................................. 8 1.4 EGFR in der Medizin und in der Wirkstoffforschung ............................................................. 10 2 Zielsetzung ......................................................................................................................................................... 15 3 Beobachtung konformationeller Änderungen in der Rezeptortyrosinkinase EGFR ........... 17 3.1 Design der FLiK-Konstrukte ............................................................................................................. 18 3.2 Expression in Insektenzellen (Exkurs) ......................................................................................... 22 3.3 Isolierung und Markierung der FLiK-Konstrukte .................................................................... 24 3.3.1 Reinigung von EGFR-FLiK ........................................................................................................ 25 3.3.2 Markierung mit Acrylodan ....................................................................................................... 28 3.3.3 Bestimmung von Dissoziationskonstanten ....................................................................... 31 3.3.4 Bestimmung von Bindungskinetiken .................................................................................. 34 3.4 Zusammenfassung ................................................................................................................................ 38 4 Kristallisationsstudien an EGFR mit neuartigen Inhibitoren ....................................................... 39 4.1 Konstruktdesign und die Expression in Insektenzellen. ....................................................... 40 4.2 Isolierung der EGFR-Kristallisationskonstrukte ...................................................................... 44 4.2.1 Analyse von Phosphorylierungsstufen ............................................................................... 47 4.3 Kristallisation von EGFR-WT und EGFR-T790M ...................................................................... 49 4.4 Zusammenfassung ................................................................................................................................ 66 5 Identifikation neuer HER2-Inhibitoren ................................................................................................. 67 II Inhaltsverzeichnis 5.1 Konstruktdesign und Expression von HER2 in Insektenzellen .......................................... 68 5.2 Reinigung der HER2-Konstrukte ..................................................................................................... 70 5.3 Kristallisation des HER2-Wildtyp ................................................................................................... 71 5.4 Bestimmung enzymatischer Parameter für den Aktivitätsassay ....................................... 74 5.5 High Throughput Screening zur Identifikation von selektiven Inhibitoren der HER2 Exon 20 Insertionsmutante ............................................................................................................................. 75 5.6 Zusammenfassung ................................................................................................................................. 81 6 Material und Methoden ................................................................................................................................ 83 6.1 Verbrauchsmaterial .............................................................................................................................. 83 6.2 Verwendete Reagenzien, Nährmedien, Zellen und Kits ......................................................... 84 6.3 Verwendete Geräte ............................................................................................................................... 84 6.4 Plasmide .................................................................................................................................................... 86 6.5 Mutagenese .............................................................................................................................................. 86 6.6 Proteinexpression in Insektenzellen ............................................................................................. 87 6.6.1 Isolierung der Bacmid-DNA ..................................................................................................... 88 6.6.2 Transfektion und erste Generation rekombinanter Baculoviren ............................ 88 6.6.3 Virusamplifikation zweite und dritte Virusgeneration ............................................. 88 6.6.4 Präparative Expression in Insektenzellen ......................................................................... 89 6.7 Proteinisolierung ................................................................................................................................... 89 6.7.1 EGFR – FLiK-Konstrukte ........................................................................................................... 90 6.7.2 HER2 und EGFR – Kristallisationskonstrukte .................................................................. 92 6.8 Massenspektren ..................................................................................................................................... 94 6.9 Aktivitätsassay ........................................................................................................................................ 94 6.10 FLiK-Assay ................................................................................................................................................ 95 6.10.1 Messung der Dissoziationskonstanten ............................................................................... 95 6.10.2 Messung der Bindungskinetiken ........................................................................................... 96 6.11 Röntgenstrukturanalyse ..................................................................................................................... 96 6.11.1 Fine-Screens .................................................................................................................................... 97 6.11.2 Big-Screens ...................................................................................................................................... 97 Inhaltsverzeichnis III 6.11.3 Additive-Screens ............................................................................................................................ 97 7 Literatur .............................................................................................................................................................. 99 8 Anhang .............................................................................................................................................................. 107 8.1 Ergebnisse des FLiK-Assay mit dem DFG+5-Konstrukt ..................................................... 107 8.2 Hit-Substanzen des HER2-Screens .............................................................................................. 108 8.3 Sequenzen der Konstrukte ............................................................................................................. 114 8.3.1 EGFR-Kristallisationskonstrukt .......................................................................................... 114 8.3.2 EGFR – FLiK-Konstrukt .......................................................................................................... 115 8.3.3 HER2 – Assayund Kristallisationskonstrukte ............................................................ 116 9 Publikationen ................................................................................................................................................. 119 
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2015
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Masalah dalam penelitian ini ada dua, yaitu 1) Bagaimanakah bentuk kon flik kejiwaan tokoh „kakak‟ dalam novel Lelaki Laut… Expand
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2012
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Flagellen sind einzigartige Maschinen im Nanomaßstab, durch deren Rotation sich Bakterien in flüssiger Umgebung fortbewegen. Die… Expand
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