................................................................................................................................................. 6 Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................................................... 8 Abbildungsverzeichnis ......................................................................................................................... 14 Tabellenverzeichnis ............................................................................................................................. 16 1 Einleitung ........................................................................................................................................ 18 1.1 G-Quadruplexe .......................................................................................................................... 18 1.2 Bedeutung der G-Quadruplexe und bioinformatische Analyse der G-Quadruplex-formenden Sequenzen ................................................................................................................................ 19 1.3 RNA G-Quadruplexe ................................................................................................................. 22 1.3.1 G-Quadruplexe in UTRs und ORFs ................................................................................... 23 1.4 Evidenz für G-Quadruplexstrukturen in vivo ............................................................................. 25 1.5 Interaktionspartner von G-Quadruplexen .................................................................................. 26 1.6 Untersuchte 5 ́-UTR G-Quadruplexe ........................................................................................ 28 1.6.1 „Actin related protein 2/3 complex subunit 2“ ..................................................................... 28 1.6.2 „B-cell CLL/Lymphoma 2“ .................................................................................................. 29 1.6.3 „Matrix metallopeptidase 16“ .............................................................................................. 30 1.6.4 „Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog“ ................................................................. 30 1.7 Apoptose (programmierter Zelltod) ........................................................................................... 31 1.7.1 Der extrinsische Signalweg ................................................................................................ 33 1.7.2 Der intrinsische Signalweg ................................................................................................. 34 1.7.3 Weitere Formen des Zelltodes ........................................................................................... 35 Inhaltsverzeichnis 2 1.7.4 Chemotherapeutika Etoposid ........................................................................................... 35 1.8 Genomeditierung mit Hilfe des CRISPR/Cas9 Systems ........................................................... 36 1.9 Orbitrap...................................................................................................................................... 41 2 Zielsetzung ...................................................................................................................................... 42 3 Material und Methoden ................................................................................................................... 43 3.1 Geräte........................................................................................................................................ 43 3.2 Chemisch kompetente E. coli und humane Zelllinie ................................................................. 44 3.3 Chemikalien, Puffer und Kits ..................................................................................................... 45 3.3.1 Oligonukleotide................................................................................................................... 53 3.4 Methoden .................................................................................................................................. 55 3.4.1 Bioinformatische Analyse von RNA G-Quadruplexen........................................................ 55 3.4.2 Spektroskopische Untersuchung zum Nachweis der G-Quadruplexstrukturen ................. 55 3.4.3 Kultivierung humaner Zelllinien .......................................................................................... 56 3.4.4 Analyse des Einflusses der G-Quadruplexe auf Transkription und Translation ................ 57 3.4.5 SILAC, Pull-Down Assay und LC-Orbitrap Massenspektrometrie ..................................... 61 3.4.6 Genomische Deletion einer G-Quadruplex-kodierenden Sequenz mittels CRISPR/Cas9 System ............................................................................................................................... 65 4 Ergebnisse ...................................................................................................................................... 75 4.1 Bioinformatische Charakterisierung der RNA G-Quadruplexe.................................................. 75 4.2 Spektroskopische Charakterisierung in ARPC2, Bcl-2, MMP16 und NRAS ............................. 77 4.3 RNA G-Quadruplexe hemmen die Translation ......................................................................... 78 4.4 Identifizierung RNA G-Quadruplex-bindender Proteine ............................................................ 80 4.4.1 Vergleich mit einer publizierten RNA-Interaktomstudie ..................................................... 88 4.5 Induktion biallelischer Mutationen in der G-Quadruplex-bildenden Sequenz von Bcl-2 in der humanen Melanom Zelllinie A-375............................................................................................ 89 Inhaltsverzeichnis 3 4.6 Vergleich der endogenen Bcl-2 Expression zwischen A-375 und A-375_Bcl-2 GQmt Zellen .. 93 4.7 Apoptoseassay .......................................................................................................................... 96 5 Diskussion ....................................................................................................................................... 98 5.1 Charakterisierung der RNA G-Quadruplexe ............................................................................. 99 5.2 Negativer Einfluss der RNA G-Quadruplexen auf Translation ................................................ 101 5.3 Interaktionspartner von RNA G-Quadruplexe ......................................................................... 102 5.3.1 Unterschiedliche Proteinbindungsmuster der G-Quadruplexe ........................................ 103 5.3.2 Interaktionspartner der NRAS und MMP16 G-Quadruplexe ............................................ 104 5.3.3 Interaktionspartner der Bcl-2 und ARPC2 G-Quadruplexe .............................................. 106 5.3.4 G-Quadruplex-bindende Proteine mit Helikaseaktivität ................................................... 110 5.4 Genomische Deletion des Bcl-2 G-Quadruplex ...................................................................... 113 5.4.1 Effekt der 5 ́-UTR der Bcl-2 mRNA auf die Translation im Reporterassay ...................... 114 5.4.2 Effekt der G-Quadruplex in der 5 ́-UTR der Bcl-2 mRNA auf die endogene Expression 115 5.4.3 Effekte des Bcl-2 G-Quadruplex auf die Apoptose .......................................................... 116 6 Schlussfolgerung .......................................................................................................................... 117 7 Ausblick ......................................................................................................................................... 119 8 Literaturverzeichnis ....................................................................................................................... 122 9 Anhang .......................................................................................................................................... 137 10 Publikationen ................................................................................................................................ 167