.................................................................................................................................... X 1 Einleitung ............................................................................................................................ 1 1.1 Intrazelluläre bakterielle Strukturen ............................................................................ 1 1.2 Polyphosphat ............................................................................................................... 4 1.2.1 Polyphosphatabhängige Enzyme .......................................................................... 6 1.2.2 Volutin Granula .................................................................................................... 8 1.2.3 Polyphosphatstoffwechsel in Ralstonia eutropha .............................................. 11 2 Zielsetzung ........................................................................................................................ 13 3 Material und Methoden ..................................................................................................... 15 3.1 Organismen ................................................................................................................ 15 3.2 Plasmide ..................................................................................................................... 16 3.3 Primer ........................................................................................................................ 19 3.4 Nährmedien ............................................................................................................... 23 3.4.1 Komplexmedien ................................................................................................. 24 3.4.2 Mineralmedien ................................................................................................... 24 3.5 Sensitivitätstest gegenüber Stressfaktoren auf Agaroseplatten ................................. 25 3.6 Antibiotika ................................................................................................................. 25 3.7 Stammhaltung und Konservierung ............................................................................ 26 3.8 Zellkultivierung ......................................................................................................... 26 3.8.1 Kultivierung von Escherichia coli ..................................................................... 26 3.8.2 Kultivierung von Ralstonia eutropha H16 ......................................................... 26 3.8.3 Kultivierung von Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 .......................... 27 3.8.4 Kultivierung von Pseudomonas putida KT2440 ................................................ 27 3.9 Analytische Methoden ............................................................................................... 27 IV 3.9.1 Fluoreszenzmikroskopie ..................................................................................... 27 3.9.2 Fluoreszenzspektroskopie .................................................................................. 28 3.9.3 Gaschromatographie ........................................................................................... 28 3.10 Biochemische Methoden ........................................................................................... 29 3.10.1 Reinigung von Proteinen .................................................................................... 29 3.10.2 Ganzzell-Biokatalyse und Polyphosphat-Extraktion ......................................... 29 3.10.3 Proteinbestimmung nach BCA ........................................................................... 30 3.10.4 Polyacrylamid-Gelelektrophorese ...................................................................... 30 3.10.5 Proteinund Polyphosphatfärbung ..................................................................... 32 3.10.6 Bakterielles Adenylatcyclase two-hybrid-System .............................................. 33 3.10.7 Suche nach Interaktionspartnern mittels Genbank von Ralstonia eutropha ...... 33 3.10.8 Miller-Assay für 96-well Platten ........................................................................ 35 3.10.9 Pull-down-Experiment ....................................................................................... 36 3.10.10 Proteomanalyse ................................................................................................... 36 3.11 Gentechnische Methoden .......................................................................................... 40 3.11.1 Vorbehandlung von Geräten und Lösungen ....................................................... 40 3.11.2 Isolierung von genomischer DNA aus Ralstonia eutropha ............................... 40 3.11.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli ........................................... 41 3.11.4 Standard-Agarose-Gelelektrophorese von DNA ................................................ 41 3.11.5 Präparation von Nukleinsäuren aus Agarosegelen ............................................. 41 3.11.6 Enzymatische Modifikation von DNA ............................................................... 41 3.11.7 Ligation von DNA-Fragmenten ......................................................................... 42 3.11.8 Polymerasekettenreaktion (PCR) ....................................................................... 42 3.11.9 Aufreinigung der PCR-Produkte ........................................................................ 43 3.11.10 Gibson-Klonierung ............................................................................................. 43 3.11.11 Gerichtete Mutagenese ....................................................................................... 44 3.11.12 Sequenzierung .................................................................................................... 44 3.12 Mikrobiologische Methoden ...................................................................................... 44 V 3.12.1 Herstellung der Deletionsmutanten .................................................................... 44 3.12.2 Herstellung von kompetenten Escherichia coli Zellen ...................................... 45 3.12.3 Herstellung von kompetenten Pseudomonas putida Zellen ............................... 45 3.12.4 Konjugation ........................................................................................................ 45 3.12.5 Schnelle Konjugation ......................................................................................... 46 3.12.6 Konjugation von Magnetospirillum gryphiswaldense ....................................... 46 4 Ergebnisse ......................................................................................................................... 47 4.1 Polyphosphat in Ralstonia eutropha .......................................................................... 47 4.1.1 Polyphosphatkinasen, Exopolyphosphatase und PhaX ...................................... 49 4.1.2 Proteomanalyse zweier Polyphosphatkinase – Deletionsmutanten ................... 53 4.1.3 Polyphosphat Granula-Verteilung in Ralstonia eutropha .................................. 55 4.1.4 Hülle des Polyphosphat Granulums ................................................................... 58 4.2 Polyphosphatabhängige Proteine ............................................................................... 59 4.2.1 In silico-Screenings nach neuen polyphosphatabhängigen Enzymen ................ 60 4.2.2 Polyphosphat Granula-Anreicherung und Proteomanalyse ............................... 62 4.2.3 Identifizierung neuer Polyphosphat Granula-assoziierter Proteine .................... 63 4.2.4 Pull-down-Experimente ..................................................................................... 71 4.2.5 Two-hybrid-Experimente ................................................................................... 76 4.2.6 Heterologe Expression der Polyphosphatkinasen in Escherichia coli ............... 82 4.3 Polyphosphatkinase – Deletionsmutante ................................................................... 85 4.3.1 Expression der Polyphosphatkinasen in der Siebenfachdeletionsmutante ......... 87 4.3.2 Physiologische Untersuchungen der Siebenfachdeletionsmutante .................... 89 4.4 Charakterisierung dreier Polyphosphat Granula-assoziierter Proteine ...................... 96 4.4.1 A1212 – PPK2c .................................................................................................. 96 4.4.2 A2437 – PPK1a ................................................................................................ 100 4.4.3 A0104 ............................................................................................................... 102 4.5 CHAD-Proteine ....................................................................................................... 130 4.5.1 A0104und B1017-Deletionsmutanten ........................................................... 131 VI 4.5.2 CHAD-Proteine in anderen Mikroorganismen ................................................ 132 4.5.3 Gerichtete Mutagenese in der CHAD-Domäne................................................ 134 5 Diskussion ....................................................................................................................... 138 5.1 Aspekte des Polyphosphatstoffwechsel in Ralstonia eutropha ............................... 138 5.2 Proteinabhängige Verteilung der Polyphosphat Granula in der Zelle ..................... 142 5.3 Biochemische Interaktionen von A0104 und deren Bedeutung .............................. 147 5.4 Untersuchungen zu CHAD-Proteinen ..................................................................... 150 5.5 Physiologie der Siebenfachdeletionsmutante und der PHB-Stoffwechsel .............. 152 5.6 Ausblick .....................................................